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核心提示:从细胞中分离总 RNA
的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要,例如,Northern
印迹及杂交分析,寡聚纤从细胞中分离总 RNA
的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要,例如,Northern
印迹及杂交分析,寡聚纤维素选择分离mRNA ,cDNA
文库的构建等实验的成败在很大程度上取决于总RNA
的提取质量[1]。从真核细胞中提取的总R N A
用凝胶电泳分析,根据是否得到代表三种最显著 r R N A 分子的特征带型(
2 8 srRNA,18s rRNA 和 5s rRNA ),来检测总 RNA
提取的完整性[2],而根据A260/A280 与 A260/A230
的比值可验证总R N A 的纯度。 完整的总R N A
可以通过多种方法从真核细胞中提取。而细胞的类型和提取方法对能否得到未降解总RNA有一定影响
,比如在本试验中所用的原料酿酒酵母就是一类特殊类型的细胞,其具有特殊的细胞壁结构,由甘露聚糖和葡聚糖组成,利用现在最流行的总R
N A 一步提取法即TRIZOL 试剂盒提取法得到的总RNA
不完整,只具有5s rRNA 条带,而利用传统的热酸性酚法虽然提取的R N

质量较高,但步骤复杂、需时较长且不利于多个样品同时操作,本试验针对这种现状,对TRIZOL
法提取步骤进行部分改进,以期得到一种既方便、快速又能得到高质量总 R N
A 的方法。1 材料与方法1.1 材料 酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)AS2
1416购于中国科学院微生物所菌种保藏中心,酿酒酵母 #215
为本实验室保藏,TRIZOL 试剂盒购自于上海生工生物公司(加拿大BBI
产品)。1.2 方法 将酵母菌在 1 0 m l
完全培养基中培养至指数中期(OD600=1.0),按下述两种方法分别提取酵母菌总RNA。1.2.1
热酸性酚法提取酵母菌总RNA 参照文献[1]中的方法略有改进[3]。取
1ml 上述指数中期酵母培养液于4℃,1500×
g离心3min,弃上清。菌体沉淀用1ml
冰冷水重悬转移至一个干净的离心管中,4℃离心 10s,弃上清。用 400μl
TES 溶液重悬细胞沉淀,加400μl 酸性酚,激烈振荡 10s。65℃温育
30~60℃,其间不时振荡混合。冰浴放置5min,4℃,12000 ×g离心
5min,水相移至一个干净的离心管中加 400μl 酸性酚,振荡,冰浴放置
5min,4℃,12000× g 离心5min,将水相移到一新管中加40μl
3mol/L乙酸钠及1ml冰冷的无水乙醇,4℃,12000 ×g 离心
5min,在冰冷70% 乙醇中快速振荡洗涤RNA 沉淀,12000 × g
离心5min,RNA 沉淀用DEPC 水(后文记做
DEPC-H2O)重溶。产物用于电泳分析或在-20℃保存。1.2.2
TRIZOL 试剂盒提取酵母菌总RNA 按BBI 公司提供的TRIZOL
试剂使用说明书进行操作:取1ml
指数中期的酵母培养液,经计数后(酵母菌每1×108个加1ml
TRIZOL)离心收集菌体,加入1ml
TRIZOL,混匀,激烈振荡,室温放置5min,加入200μl
氯仿,剧烈振荡30s,12000 × g 离心
5min,上层水相移入一个新离心管中,加入等体积的异丙醇,室温放置 5m
i n ,12000 ×g 高速离心5min 弃上清,用 75% 乙醇洗涤
RNA沉淀2 次,用30μl DEPC-H2O 溶解 RNA
沉淀。产物用于电泳分析或在-20℃保存。1.2.3 TRIZOL
试剂盒改进方法提取酵母菌总RNA
在收集菌体之前加入1%的蜗牛酶30℃温育20min(对照组温育 5 0 m
i n ),然后进行菌体离心收集加入 1 m
lTRIZOL,混匀,振荡,冰浴5min,加入200μl
氯仿,剧烈振荡30s,12000 ×g,4℃离心
5min,上层水相移入一个新离心管中,加入等体积的异丙醇,冰浴5min,12000
×g,4℃离心10min,弃上清,用 75%乙醇洗涤RNA 沉淀2 次,用
30μl DEPC-H2O 溶解 RNA沉淀。产物用于电泳分析或在-20
℃保存。1.3 总R N A 浓度及纯度检测 将采用上述三种方法得到的酵母总
RNA 溶于DEPC-H2O 中,取一定量的样品稀释 N 倍至 20 0μl
混匀,加入微量比色杯中,用紫外分光光度计测量样品的 A ,
230A260,A280 的值(以DEPC-H2O 为空白调整零点)。
RNA 样品浓度为:A260 ×N ×
40/1000。据此浓度计算酵母菌总RNA 产量,以
A260/A280,A / 260A230 比值的大小判定RNA
样品的纯度。每样品重复3 次取平均值[3]。1.4 总 R N A 完整性检测
取少量三种方法所得总 RNA 样品与溴酚蓝上样缓冲液混匀后,在 1 %
琼脂糖凝胶、T A E 缓冲液中6 0 ℃电泳 1 h
,用上海东方凝胶成像仪摄像。2 结果与分析2.1 三种提取方案总 RNA
产量比较 热酸性酚法,TRIZOL 法,TRIZOL
改进法,提取的总RNA经测定A260的三次平均值分别为0.296、0.298、0.122,根据1.3中公式(A260×
N × 40/1000)计算总
RNA产量分别为1.184、0.488、1.192μg/μl。所以
1ml指数中期的酵母培养液得到的总R N A
量中,热酸性酚法获得的总RNA 量为 35.52μg ;而 TRIZOL
方法得到的总RNA 量最少,为14.64μg;改进后的TRIZOL
方法RNA产量大大提高,达到35.76μg。由上述结果可知,改进的
TRIZOL 方法提取酵母总RNA
产量大大提高,一方面是由于加入对酵母细胞壁有特异性破坏作用的酶使酵母的
RNA
大部分被释放出来,这是本方法产量提高的最主要原因,另一方面,由于改进方法中使用了冰浴,且离心时使用了冷冻离心机
离心,使 R N A 的降解率降低,这样使总R N A
的纯度和完整性都有所提高。2.2 三种方法提取酵母菌总RNA 纯度的比较

随着汽车工业的发展,环境保护日益为人们所关注,汽油清净分散剂的重要性日趋显著,各种添加剂的合成与研究进展迅速。在美国,1996年加剂汽油已达90%以上,清净分散剂成为当前汽油添加剂研究开发的热点。本文主要介绍了一种新型汽油清净分散剂合成的问世。

汽车在给人们生活带来方便的同时,也给人类的生活环境造成了很大的威胁,汽车排放的有害物质已成为世界各大城市大气污染的主要来源。近年来,随着科技进步和环保压力增大,世界上新型电喷嘴汽车正在逐步取代原有的化油器式发动机汽车。

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1汽油添加剂的合成采用聚醚醇与磷氧化物,以四氯化磷作溶剂进行磷酸脂化反应,制得聚醚磷酸酯类化合物,反应温度为30℃~90℃,恒温条件下反应若干小时,中间出样,测定体系中的酸值(%),待达到理论值时,停止反应、进行蒸馏、回收溶剂,产物用电位滴定法测单、双酯含量。主要反应式为3ROH磷酸化反应(RO)PO(OH)2+(RO)2PO(OH)

围绕清洁汽油的生产,各大炼油厂纷纷采用了降烯烃催化裂化、烷基化、异构化等生产工艺,但是从目前的实际情况来看,在汽油中添加清净分散剂不失为解决这一问题的一个极其有效且可能是更经济快速改善汽油质量、降低汽车排放污染的措施。汽油清净分散剂在一些发达国家使用已比较普遍,如美国、日本规定优质汽油中必须添加汽油清净分散剂。随着我国经济与世界接轨,国家环保总局于1998年12月向全国下发的“关于对《车用汽油有害物质控制标准》征求意见的通知”中,明确表示汽油中必须加入清净分散剂。因此,使用汽油清净分散剂,以降低汽车排放污染、改善城市环境已成大势所趋。

2实验室初步试验

1汽油清净分散剂的作用机理汽车燃油系统沉积物的形成主要有两方面原因,一是由于汽油本身存在胶质、杂质,以及在生产、运输、贮存过程中所携带的锈渣等,导致在汽车油箱、进油管等部位形成类似油泥的沉积物;二是由于喷嘴、进气阀处工作温度较高,汽油中存在的烯烃(特别是二烯烃)等不安定组分极易发生氧化和缩合反应,形成胶质和树脂状积垢,这些积垢又吸附周围环境的颗粒物质,最终以积炭的形式沉积在喷嘴、进气阀、燃烧室等部位。同时,汽油中添加的含氧组分(如MTBE等)对这一过程的氧化反应起到了催化作用,使汽油中的不安定组分更易生成沉积物。化油器沉积物产生于油量孔、空气量孔、怠速孔附近,喷嘴、进气阀沉积物产生于针阀、孔表面,它们均导致怠速不稳,加速性变差,油耗增加,碳氢化合物、一氧化碳和氮化物等有害气体排放增加;燃烧室沉积物导致局部过热、预燃、爆震,使燃烧效果变差,尾气污染物增加。汽油清净分散剂主要由清净分散组分、防锈组分、破乳组分、抗氧组分以及稀释油组成,是一种具有清净、分散、破乳和防锈性能的多功能的复合汽油添加剂。汽油清净分散剂兼含极性基团和非极性基团,其极性基团(如聚异丁烯基团等)伸入汽油中,将已形成的沉积物的微小颗粒包围起来,形成油溶性胶束,分散到油中,随油燃烧,达到清洗的目的;其非极性基团(如多烯多胺基团等)优先吸附在金属或离子表面,形成了一层分子保护膜,防止了粒子的聚集沉积或在金属表面粘附,起到保持清洁的作用。

2.1溶解性试验称取0.1g样品置于10g溶剂相中,混合均匀,考查化合物在油中的溶解性能。溶解性好的添加剂,将有较好的清净分散效果。实验采用燕山石化公司低粘度中性油作为溶剂相,以防止挥发及成品油中其他添加剂的影响而增加试验的苛刻度。实验所得的聚醚磷酸酯溶于2号油中得到黄黑色均相液体,将样品加入量提高一倍,仍为均相液体而无悬浮的油珠出现,故认为样品在2号油中可溶。由表1可知,实测所得样品在1号和2号油中间均具有极好的溶解性。

2汽油清净分散剂的分类从时间上来看,汽油清净分散剂可分为4个阶段。第一代汽油清净分散剂是1954年由Chevron公司推出的,主要解决了汽车化油器的积炭问题,其代表性化合物是普通胺类(如分子量为300~400的氨基酰胺);第二代汽油清净分散剂是1968年美国的Lubrizol公司在第一代汽油清净分散剂的基础上开发的,主要解决了喷嘴堵塞的问题,其代表性化合物是聚异丁烯琥珀酰亚胺;第三代汽油清净分散剂是一种集清净、分散、抗氧、防锈、破乳多种功能为一体的复合添加剂,它是20世纪80年代中期出现的,不仅解决了化油器、喷嘴和进气阀积炭问题,而且能有效抑制燃油系统内部生成沉积物,迅速清除燃油系统已经生成的沉积物;第四代汽油清净分散剂是针对无铅汽油的使用而问世的,目的是进一步解决汽油燃烧室内沉积物问题,其代表性结构是1980年以来Chevron
BASF等公司开发的一系列聚醚胺型汽油清净分散剂。汽油清净分散剂按其化学结构大致可分为两类:小分子胺类和低聚物胺类。小分子胺类为应用最早的清净分散剂,如单丁二酰亚胺、双丁二酰亚胺、N
苯硬酯酰胺等。低聚物胺类包括烷基胺化物类、Mannich反应产物类、异氰酸酯类衍生物、酸酯类和醚醇类等。烷基胺化物类中最常用的是聚异丁烯琥珀酰亚胺类。Mannich反应产物类是近年来Texaco公司、BP公司等利用琥珀酰亚胺与烷基酚在甲醛溶液中发生Mannich反应的产物;异氰酸酯类衍生物为近年来出现的一类高效清净分散剂,如日本专利介绍用异氰酸酯与聚醚及胺进行聚加成反应生成的N
取代氨基甲酸酯化合物,天津大学合成的脲基氨基甲酸酯清净分散剂;酸酯类和醚醇类主要有Shell公司利用聚异丁烯丁二酸酐与烷基聚醚醇反应的产物和Texaco公司利用内酯和烷基取代的苯氧基聚乙二醇胺反应的产物。

2.2结焦实验结焦实验采用铝制品模拟内燃机中形成沉积物的过程。将一定规格的铝片经各种预处理后,滴上加剂参比油,加热,维持200℃恒温10min,放入干燥皿内冷却到室温,然后称量其质量。加剂参比油在铝试片上的结焦量按下式计算,得出化合物相对结焦率φ=W2-W1W′2-W′1%式中φ——相对结焦率,%W1——加剂参比油试验前铝片质量W2——加剂参比油试验后铝片质量W′1——本实验合成样品试验前铝片质量W′2——本实验合成样品试验后铝片质量在试验时,先取同样量的参比样品加入到1号油中配成加剂油,然后在相同的条件下向铝试片上滴加同量的加剂油,考察各种加剂油的结焦情况。加剂油的编号情况如下No
1加剂油是国内生产的一种磷酸脂型汽油添加剂溶于1号油所得到的澄清透明加剂油。No
2加剂油是实验合成的汽油添加剂溶于1号油所得的澄清透明加剂油。No
3加剂油是市售美国JB公司生产的JB汽油添加剂溶于1号油中所得的澄清透明的加剂油。No
4加剂油是市售美国Wynn′sOilCornpany生产的x-tend88Plus汽油添加剂溶于1号油所得的加剂油。以本实验所合成的添加剂为标准,评定其他加剂油相对其结焦性能的好坏。由表2可知,本实验合成的添加剂在结焦性能上优于国内生产的磷酸酯型汽油添加剂,与美国JB公司的产品不相上下,但稍逊于Wynn公司x-tend88Plus添加剂。

3汽油清净分散剂的功能及使用效果作为一种多效复合添加剂,汽油清净分散剂不但包括清净分散剂,还包括诸如防锈剂、抗氧抗腐剂、减摩剂、破乳剂和稀释剂等微量组分。清净分散剂是汽油清净分散剂的核心,它对节气门、化油器的积炭具有清洗功能,能消除汽车怠速不稳、加速时供油不畅、油耗增加、尾气排放恶化等现象;对电喷车的燃油喷嘴具有清洗功能,能够消除供油不畅、驱动性能下降、尾气排放恶化等问题;对电喷车的进气阀具有清洗功能,消除阀杆粘结、阀门封闭不严、气缸工作压力下降、燃烧不完全以及爆震等问题。防锈剂可以防止发动机部件因燃烧产生的锈蚀和阀座磨损。抗氧抗腐剂可以抑制汽油中的烯烃氧化,减少沉积物的生成。减摩剂能有效地提高汽油的润滑和减摩性能。破乳剂可以防止汽油使用过程中遇水而引起油层乳化以及油水界面形成浮渣导致的发动机运转不良。稀释剂可以增加汽油清净分散剂与汽油的混溶性。因此,汽油清净分散剂可以有效抑制燃油系统沉积物的形成,畅通油路,维持发动机正常运转,减少汽车维护保养费用,降低油耗,改善尾气排放。实际应用结果表明,一般汽车正常行驶4000km,化油器发动机就需清洗或更换,而使用汽油清净分散剂后,维修周期可延长到10000km以上,并且节油达5%。对于电喷发动机汽车,添加汽油清净分散剂的汽油行驶16000km,在排气污染不恶化的条件下,可使喷射堵塞率控制在原来的10%以内。表1列出了中国石化股份有限公司石油化工科学研究院研制的RP97汽油清净分散剂在几种不同车型上的行车试验结果。从表中可以看出这种汽油清净分散剂在降低汽车尾气中一氧化碳和碳氢化合物排放方面具有优越性。

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3除碳性能试验试验采用纯铝模拟内燃机中沉积物的去除过程,将预处理后的上述规格的铝质锅式试片,滴加未加剂的1号油,加热,维持300℃恒温10min,使生成积碳,再放入干燥皿内冷却至室温后,再加热,维持200℃恒温10min,滴加上述加剂油,考察积碳变化情况。若积碳变薄且呈多孔蓬松状,则易被燃烧气流吹走,添加剂将有较好的除碳效果;若积碳表面基本无变化且又不变薄,甚至更趋光洁致密,则除碳效果差。由表3可知,实验合成的汽油添加剂在除碳性能方面优于国内生产的磷酸脂型添加剂,可与美国的JB汽油添加剂和x-tend88Plus汽油添加剂的除碳能力相媲美,是一种有效的汽油添加剂。

4汽油清净分散剂的研究现状国外对汽油清净分散剂的研究比较早,第一代至第四代汽油清净分散剂基本上都是国外石油公司和研究单位开发的,目前商品化的汽油清净分散剂也很多。国内对汽油清净分散剂的研究起步较晚,目前只有天津大学内燃机研究所、石油化工科学研究院、兰州炼油厂研究院等单位进行了有关汽油清净分散剂的研究。天津大学内燃机研究所采用二异氰酸酯与醇类、胺类化合物进行化学反应合成了一种新型化合物——脲基氨基甲酸酯清净分散剂,试验表明,该剂具有较好的油溶性,能减少进气阀及喷嘴上的结焦和积炭胶粘现象;石油化工科学研究院研制的邦洁牌汽油清净分散剂目前正处于试用推广阶段。

3讨论本研究所合成的清净分散剂已显示出初步效果,但需进一步改进完善,进行更加严密的模拟试验,如:汽油喷嘴的堵塞试验,进气门沉积物试验,在此基础上进行汽油机清理积碳和沉积物的台架运行考核。

5汽油清净分散剂的应用情况汽油清净分散剂在欧洲、美国等工业发达国家使用非常普遍,1985年美国有60%的汽油加入了汽油清净分散剂,而1989年加剂汽油已超过80%。1990年美国公布的《清洁空气法》修正案中明确规定新配方汽油从1995年起必须加入汽油清净分散剂。目前汽油清净分散剂在美国的年销量已超过220kt。在德国,99%的汽油添加了汽油清净分散剂,其它欧洲国家的加剂汽油也达到了70%~80%。表2列出了世界上汽油清净分散剂的使用统计情况。

汽油清净分散剂在我国应用还不普遍,目前只有北京、上海、广州三大城市首先实施1999年12月28日发布的《车用无铅汽油》国家标准(GB17930-1999),在车用汽油中添加了汽油清净分散剂,全国绝大部分城市和地区执行这一标准还需相当长的一段时间。从我国的实际情况来看,随着我国汽车工业新技术的引进及对外汽车贸易的发展,电喷车的拥有量逐年递增,正在逐步取代原有的化油器式发动机汽车。由于电喷式发动机燃油喷嘴对沉积物极为敏感,所以必须使用汽油清净分散剂来缓解这一恶劣情况的发生。此外,从我国的车用汽油调和组分构成来看,催化裂化汽油占的比重太大,如中国石油天然气集团公司催化裂化汽油所占比例达73.93%,而美国和欧洲的催化裂化汽油分别只占36.2%和27%。催化裂化汽油占的比重过大直接导致了烯烃含量偏高,如果不加入汽油清净分散剂,会使汽车尾气排放污染加剧。基于以上考虑,研制出适合我国汽油特点的汽油清净分散剂、建立一套完善的性能评价标准、加大汽油清净分散剂在我国的推广应用力度将是非常必要的。

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